Konfokalmikroskope zeichnen sich unter den optischen Mikroskopen durch eine sehr hohe räumliche Auflösung aus. In einem modernen Verfahren, der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, finden sie breite Anwendung bei der Zellabbildung im biomedizinischen Bereich und der hochpräzisen Formmessung in der Halbleiterindustrie. Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie basiert auf einem konfokalen optischen System, bei dem eine punktförmige Lichtquelle in das Präparat abgebildet wird, wobei in der Zwischenbildebene eine Lochblende und ein Detektor angeordnet sind.
Das Konfokalmikroskop wurde bereits 1957 von Marvin Minsky zum Patent angemeldet, also noch vor der Erfindung des Lasers (1960). Während ursprünglich noch Entladungslampen als Lichtquellen zum Einsatz kamen, arbeitet man heute überwiegend mit Lasern, da diese extrem hell sind und eine hohe Lichtstromausbeute aufweisen. Außerdem liefern sie monochromatisches Licht mit genau den Wellenlängen, die für die Fluoreszenzbeobachtung erforderlich sind. Daher eignen sie sich besonders für biomedizinische Anwendungen.
Die Geschichte der Entwicklung von Fluoreszenzreagenzien für die Fluoreszenzbeobachtung ist eng mit der Geschichte der verfügbaren Lichtquellen wie Quecksilberlampen und Gaslaser verknüpft. So ist beispielsweise die Verwendung von Fluoreszenzreagenzien mit Anregungswellenlängen von 365 nm (i-Linie der Quecksilberlampe) und 488 nm (Argon-Ionen-Laser) ein Relikt aus dieser Geschichte. Beispiele für Anregungswellenlängen, die in der biomedizinischen Konfokalmikroskopie verwendet werden, sind 405, 488, 514, 561, 594, 640 und 647 nm, die häufig mit Halbleiterlasern erzeugt werden.
Typologie der Konfokalmikroskope nach dem Scanning-Verfahren
Da das konfokale optische System nur einen einzelnen Raumpunkt erfassen kann, muss die Detektionsposition auf dem Präparat abgetastet werden, um ein Bild zu erzeugen. Die Abtastung erfolgt durch eine Kombination aus der Bewegung des Objekttisches und der Strahlabtastung mit Hilfe einer Optik, z. B. einem Galvanometerspiegel. Bei Konfokalmikroskopen des Punktscanning-Typs mit nur einem Detektionspunkt wird aus Gründen der Lichtübertragung und der Nutzungseffizienz ein transversaler Single-Mode-Laser verwendet.
Das Konfokalmikroskop vom Typ Spinning Disk ermöglicht das Abtasten einer großen Anzahl von Detektionspunkten auf einem Präparat mittels einer rotierenden Scheibe mit einer großen Anzahl (Tausende bis Zehntausende) von präzise spiralförmig angeordneten Lochblenden. Da beim Spinning-Disk-Typ die Abtastung durch Aufteilung des Laserstrahls in mehrere Punkte erfolgt, ist es möglich, die Schädigung der zu beobachtenden Zellen (Phototoxizität) und das Ausbleichen von Fluoreszenzreagenzien durch Lichteinstrahlung zu unterdrücken. Spinning-Disk-Konfokalmikroskope können neben transversalen Single-Mode-Lasern auch Multimode-Laser verwenden.
Bei beiden Verfahren liegt die Laserausgangsleistung in der Regel bei 20–100 mW, allerdings wurden in den letzten Jahren aufgrund der Entwicklung von Verfahren mit höherer Auflösung, wie z. B. der Bildrekonstruktion, auch Laser mit höherer Leistung eingesetzt.
Auswahl an geeigneten Laserprodukten für die Konfokalmikroskopie
Aus der Vielzahl der Laserdioden von Ushio seien hier ein paar Beispiele für Produkte genannt, die für die konfokale Mikroskopie geeignet sind.
Mit einer Wellenlänge von 405 nm und einer optischen Ausgangsleistung von 300 mW (cw, Dauerstrichbetrieb) ist die HL40071MG eine Laserdiode, die die höchste optische Ausgangsleistung für eine Single-Mode-Laserdiode dieser Wellenlänge erreicht. Sie eignet sich für die Fluoreszenzanregung in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen einschließlich der konfokalen Mikroskopie.
HL40113MG/115MG, ebenfalls mit 405 nm, sind Multimode-Produkte mit 600 mW Ausgangsleistung und eignen sich für den Einsatz in Spinning-Disk-Konfokalmikroskopen sowie für Situationen, in denen eine hohe Leistung für die Fluoreszenzanregung erforderlich ist.
HL63391DG/392DG und HL65014DG sind Single-Mode-Produkte im 640-nm- bzw. 647-nm-Band und können für alle Arten von Konfokalmikroskopen verwendet werden. Alle hier vorgestellten Produkte sind in einem kleinen TO-Gehäuse mit einem Durchmesser von 5,6 mm erhältlich. Zusätzlich ist in dem Gehäuse eine Monitordiode zur Überwachung der Laserleistung untergebracht, die eine einfache Steuerung der optischen Leistung ermöglicht.
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Neben den hier vorgestellten Produkten bietet Ushio eine breite Auswahl weiterer Laserdioden für die unterschiedlichsten Anforderungen. Für weitere Informationen besuchen Sie bitte die Ushio Laserdioden-Webseite.
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